霍氏肠杆菌ZHB-3及其在抑制水产中16种病原菌中的应用

本发明属于微生物抑菌，具体涉及一种霍氏肠杆菌zhb-3及其在抑制水产中16种病原菌中的应用。

背景技术：

1、水产养殖业是我国国民经济的重要组成部分，近年来，随着工厂化养殖程度的提高以及高密度水产养殖性动物养殖规模的不断扩大，尤其是在夏季水温较高的条件下，水质条件变得复杂，水产养殖性动物容易感染各类病原菌。

2、比如，鱼类常见的症状有烂鳃、白皮、赤皮、竖鳞、细菌性败血症、细菌性肠炎、打印病、白毛病及鳃霉病等；在甲壳类中常见的细菌性疾病有红腿病、烂鳃病、瞎眼病、甲壳溃疡病及荧光病等；鳖类常见细菌性疾病有爱德华菌病、穿孔病、红脖子病及胃溃疡出血病等；蛙常见细菌性疾病有爱德华菌病、红腿病及链球菌病等。

3、水产动物的病原菌种类广泛，包括气单胞菌属(aeromonas)、爱德华氏菌属(edwardsiella)和假单胞菌属(pseudomonas)等革兰氏阴性致病菌，及金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)等革兰氏阳性致病菌，以及水霉(saprolegnia)和鳃霉(branchiomyces)等真菌类致病菌，这些水产病原菌容易造成广泛传播的流行性疾病，是限制集约化养殖的主要因素，且多数致病菌的宿主范围很广，多种水产养殖动物都存在被感染的可能性，因此在聚集的水产养殖场一旦出现病例，就极容易出现大范围传染和蔓延的现象，因此，一经传播就会造成水产养殖业的严重损失。

4、现阶段，面对大量的微生物传染病的入侵，多选择使用抗生素来抵御病原菌，但长期大量使用抗生素，会使致病菌产生耐药性，同时广谱抗生素会杀灭水产动物肠道内部分有益菌，不仅会使其免疫力及消化能力下降还会造成体内大量抗生素残留和积累，从而导致水产食品的安全受到严重影响。因此，寻找新型生态环境友好型的生物防治方法越来越受到重视。

5、近年来，使用拮抗菌等有益微生物来代替抗生素等药物进行疾病的防治已经成为研究热点，拮抗菌作为益生菌的一种，能够抑制某些病原菌的生长，并且具有无残留、无抗药性、纯天然、安全环保等优点。

6、如专利cn103966123a中，筛选出了一种拮抗菌即霍氏肠杆菌5号，其验证了其所筛选的霍氏肠杆菌5号对于水产中的枯草芽孢杆菌等5种细菌有一定的抑制能力，且进一步证明了该拮抗菌对于弧菌中的溶藻弧菌、副溶血弧菌的抑制效果最为显著。但是对于水产中可能存在的种类繁多的病原菌而言，该专利所筛选的拮抗菌其抑菌能力有限，且其并未表现出对真菌的抑制效果。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了霍氏肠杆菌zhb-3及其在抑制水产中16种病原菌中的应用。

2、本发明所提供的霍氏肠杆菌zhb-3，是筛选分离自中华鳖肠道的一株拮抗菌，于2023年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m20231037，分类命名为：enterobacter hormaechei zhb-3。

3、本发明中霍氏肠杆菌zhb-3获得的具体操作如下：

4、首先，对中华鳖进行解剖，取出其肠道内容物，中华鳖为购于河州水产公司的健康活泼无外伤的成年中华鳖。

5、其次，以病原菌死菌体为唯一营养物质，制备初步筛选平板，将取出的肠道内容物按不同稀释度涂布于初步筛选平板上，28℃恒温培养至出现菌落，并从初步筛选平板上挑取菌落进行划线分离，获得单菌落，保藏备用。

6、最后，采用菌菌互作的方式进行筛选，具体操作为：将病原细菌涂布于lb平板上，将病原真菌接种于pda平板中间，将直径为6mm的滤纸片放置在平板上，取初步筛选获得的单菌落的菌液滴加于无菌滤纸片上，正置于28℃恒温培养箱中培养24～48h，观察抑菌效果，对有抑菌效果的一株细菌进行相关生理生化及16s rdna鉴定，确定其为霍氏肠杆菌zhb-3。

7、此外，本发明还提供了该霍氏肠杆菌zhb-3在抑制水产中16种病原菌中的应用，所述的应用是采用菌菌互作模式将霍氏肠杆菌zhb-3直接应用于抑制16种病原菌的繁殖过程中，或采用培养基对霍氏肠杆菌zhb-3进行发酵培养制得无菌发酵液，然后将无菌发酵液应用于抑制16种病原菌的繁殖过程中。

8、本发明所提供的上述的应用中，菌菌互作模式的操作如下：

9、将霍氏肠杆菌zhb-3和病原菌分别培养，取培养后的病原菌菌液均匀涂布/接种于固体平板上，取直径为6mm的无菌滤纸片贴在平板表面并压实，取拮抗菌菌液滴加于无菌滤纸片上，随后正置于恒温培养箱中培养，观察抑菌效果。

10、优选的，当所述的病原菌为病原细菌时，菌菌互作模式具体操作为：

11、将霍氏肠杆菌zhb-3和病原细菌分别按0.8～1.5％的接种量接种于lb液体培养基中于28℃，180rpm下过夜培养，然后取100μlod600 nm约为1.0的病原细菌菌液均匀涂布于lb固体平板上，待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子取直径为6mm的无菌滤纸片贴在平板表面并压实，不可有缝隙产生，每张滤纸片间距不少于27mm，纸片中心距培养皿边缘不少于20mm；最后，取20μlod600 nm约为1.0的霍氏肠杆菌zhb-3的菌液滴加于无菌滤纸片上，正置于28℃恒温培养箱中培养24h，观察抑菌效果。

12、优选的，当所述的病原菌为病原真菌时，菌菌互作模式具体操作为：

13、将病原真菌菌块接种至pda培养基中间，28℃正置培养3～4天，将直径约6mm的真菌菌块接种至pda平板，放置在平板中间，长有菌丝的那一面紧贴培养基，在菌块周围1.5cm处的位置放置无菌滤纸片，然后，取20μl od600 nm约为1.0的霍氏肠杆菌zhb-3的菌液滴加于无菌滤纸片上，正置于28℃恒温培养箱中培养48h，观察抑菌效果。

14、此外，本发明所提供的上述应用中，所述的无菌发酵液的制备，具体包括以下的步骤：

15、(1)取霍氏肠杆菌zhb-3的种子液，接种于lb培养基或改良landy培养基上发酵培养；霍氏肠杆菌zhb-3发酵时的接种量为0.8～1.5％，培养液的添加量为50ml，发酵温度25～30℃，转速150～200rpm，振荡培养2～4天；

16、(2)对(1)中经发酵后获得的上清液进行冻干，获得冻干粉末，然后将冻干粉末加水溶解，获得浓缩后的发酵上清液，过滤除菌，即得无菌的浓缩发酵上清液。

17、优选的，上述的步骤(1)中，霍氏肠杆菌zhb-3发酵时的接种量为1.0％，培养液的添加量为50ml，发酵温度28℃，转速180rpm，振荡培养3天。

18、上述的步骤(1)中，所述的lb液体培养基是将酵母粉3.00～6.00g，蛋白胨8.00～10.00g，氯化钠8.00～12.00g，溶于1l蒸馏水中，调整ph为7.0～7.2，100～130℃下高压蒸汽灭菌20～40min后制备获得的。

19、优选的，步骤(1)中所述的lb液体培养基是将酵母粉5.00g，蛋白胨10.00g，氯化钠10.00g，溶于1l蒸馏水中，调整ph为7.2，121℃下高压蒸汽灭菌20min后制备获得的。

20、上述的步骤(1)中，所述的改良landy培养基是将l-谷氨酸钠2.00～10.00g，葡萄糖10.00～20.00g，磷酸二氢钾0.20～1.00g，硫酸镁0.10～0.50g，硫酸锰1.00～5.00mg，溶于1l蒸馏水中，调整ph为7.0～7.2，110～130℃下高压蒸汽灭菌20～40min后获得的。

21、优选的，步骤(1)中所述的改良landy培养基是将l-谷氨酸钠5.00g，葡萄糖15.00g，磷酸二氢钾0.50g，硫酸镁0.20g，硫酸锰2.00mg，溶于1l蒸馏水中，调整ph为7.2，115℃下高压蒸汽灭菌30min后获得的。

22、优选的，步骤(2)中采用lc-18n-50a型真空冷冻干燥机(上海力辰邦西仪器科技有限公司)对发酵后获得的上清液进行冷冻干燥。

23、优选的，(2)中采用无菌的滤膜孔径为0.22μm的一次性针式过滤器对发酵液进行过滤除菌处理，得到无菌发酵滤液。

24、本发明中采用冷冻干燥的方法对发酵后的上清液进行浓缩，相比于高温浓缩、旋转蒸发浓缩、透析袋-peg 20000浓缩等传统的浓缩方法，具有损失少、发酵液活性保持度高等优势。

25、并且，本发明中采用具有孔径为0.22μm滤膜的过滤器对发酵液进行除菌处理，相比于常用的高温高压除菌方法，如高压蒸汽灭菌、巴氏杀菌等，能够更有效保持发酵液中物质活性和成分，具有节约能源、绿色环保、操作简单、应用范围广等优势。

26、进一步的，本发明所提供的上述应用中，所述的病原菌包括病原细菌、病原真菌。

27、优选的，所述的病原菌中，病原细菌为14种，包括：按蚊伊丽莎白菌、弗格森埃希菌、简达气单胞菌、维罗纳气单胞菌、嗜水气单胞菌、摩氏摩根菌、温和气单胞菌、普通变形杆菌、变形假单胞菌、迟钝爱德华菌、弗氏柠檬酸杆菌、豚鼠气单胞菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌。

28、优选的，所述的病原菌中，病原真菌为2种，为水霉和鳃霉。

29、本发明采用菌菌互作的模式展示了霍氏肠杆菌zhb-3对不同病原菌的抑菌效果，实验结果显示，霍氏肠杆菌zhb-3对按蚊伊丽莎白菌、弗格森埃希菌、简达气单胞菌、维罗纳气单胞菌、嗜水气单胞菌、摩氏摩根菌、温和气单胞菌、普通变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、豚鼠气单胞菌和金黄色葡萄球菌等11种病原细菌表现出抑菌性，对水霉和鳃霉等2种病原真菌表现出较明显的抑菌性。

30、此外，本发明还采用两种不同的发酵培养基对霍氏肠杆菌zhb-3进行发酵，比较了不同的培养基发酵上清液对不同病原菌的抑制效果，结果显示：

31、不同的培养基发酵产物，其对于病原菌的抑制程度有较大的差异，霍氏肠杆菌zhb-3的lb培养基无菌发酵液对于豚鼠气单胞菌、弗格森埃希菌和按蚊伊丽莎白菌有较明显的抑菌效果，对嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌和变形假单胞菌有较弱的抑菌效果，对水霉和鳃霉无抑菌效果。

32、霍氏肠杆菌zhb-3的改良landy培养基无菌发酵液对温和气单胞菌、摩氏摩根菌、豚鼠气单胞菌、金黄色葡萄球菌、变形假单胞菌、迟钝爱德华菌、简达气单胞菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、按蚊伊丽莎白菌和普通变形杆菌等11种病原细菌有抑菌效果，其中以温和气单胞菌、迟钝爱德华菌、摩氏摩根菌、简达气单胞菌、变形假单胞菌、豚鼠气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为明显，对水霉和鳃霉有较弱的抑菌效果。

33、此外，将本发明中所筛选公开的霍氏肠杆菌zhb-3用于制备抑制水产病原菌的产品，同样落入本发明所要保护的技术范围之中。

34、本发明的有益效果在于：

35、(1)本发明从中华鳖的肠道内容物中筛选分离出的病原菌拮抗菌，霍氏肠杆菌zhb-3，由于其来自于水产动物的体内环境中，因而该菌株具有更好的环境适应性和肠道定植能力，且本发明的研究结果表明，霍氏肠杆菌zhb-3对水产中的16种病原菌，包括14种病原细菌以及2种病原真菌都有较强的抑菌性，可被用作水产抑菌剂类产品的添加剂。

36、(2)本发明中采用病原菌死菌体的冻干粉作为唯一的营养物质进行拮抗菌的筛选，相比先分离单菌落，再分别测定各单菌落或其发酵液对病原菌的抑菌效果的方法，本发明的方法更简单，极大地减少了工作量，大大缩短了菌种的筛选时间。